62/2000 ปกป้องสุขภาพทารกและเด็กเล็ก! Wanyi ion chromatography ตรวจวัดสารในนมแม่ 7 ชนิด
2026-09-30
คำนำ
โอลิโกแซ็กคาไรด์ในนมแม่ (HMOs) เป็นกลุ่มของโอลิโกแซ็กคาไรด์ที่มีระดับการเกิดพอลิเมอไรเซชันไม่เกิน 3 ซึ่งพบได้ตามธรรมชาติในนมแม่ เป็นส่วนประกอบที่เป็นของแข็งที่ใหญ่เป็นอันดับสามในนมแม่ รองจากแลคโตสและไขมัน HMOs ควบคุมจุลินทรีย์ในลำไส้ โดยเฉพาะอย่างยิ่งส่งเสริมการเจริญเติบโตของ Bifidobacteriaceae ในลำไส้ของทารก ขณะเดียวกันก็รักษาสุขภาพลำไส้ สนับสนุนพัฒนาการของระบบภูมิคุ้มกันและสมอง และมีฤทธิ์ต้านการติดเชื้อ มีบทบาทสำคัญในการเจริญเติบโตของทารก นับตั้งแต่การเปิดตัวนมผงสำหรับทารกที่เสริม HMOs ครั้งแรกในสหรัฐอเมริกาในปี 2015 ผลิตภัณฑ์นมผงสำหรับทารก นมและผลิตภัณฑ์จากนม อาหารเสริมเพื่อสุขภาพทางเดินอาหาร และอาหารเพื่อสุขภาพที่มี HMOs ได้รับการวางจำหน่ายทั่วโลก ณ วันที่ 1 มิถุนายน 2023 สหรัฐอเมริกาและสหภาพยุโรปได้อนุมัติ HMOs เจ็ดชนิดสำหรับการใช้งาน ได้แก่ 2'-fucosyllactose, 3'-fucosyllactose, difucosyllactose, lacto-N-neotetraose, lacto-N-tetraose, 3'-sialyllactose และ 6'-sialyllactose.
ในบรรดาวิธีการตรวจวัด HMOs ทั่วไป การโครมาโทกราฟีของเหลวต้องอาศัยปฏิกิริยาการเติมหมู่ก่อนการตรวจวัด มีขั้นตอนการเตรียมตัวอย่างที่ซับซ้อน และสารทำปฏิกิริยาเติมหมู่อาจเป็นพิษ นอกจากนี้ HMOs ที่ไวต่อความร้อนยังส่งผลให้การตอบสนองต่ำและความสามารถในการทำซ้ำไม่ดีใน LC-MS ในทางตรงกันข้าม การโครมาโทกราฟีไอออนพร้อมการตรวจวัดแบบแอมเพอโรเมตริกสำหรับคาร์โบไฮเดรต มีการเตรียมตัวอย่างที่ง่าย การตอบสนองสูง และความสามารถในการทำซ้ำที่ดี ทำให้มีข้อได้เปรียบที่ชัดเจนสำหรับการวิเคราะห์ HMOs เอกสารการใช้งานนี้ใช้โซเดียมไฮดรอกไซด์ โซเดียมอะซิเตต และน้ำบริสุทธิ์ที่เตรียมด้วยมือเป็นสารชะล้าง และใช้เครื่องโครมาโทกราฟไอออน WAYEAL IC6300 เพื่อกำหนด HMOs ในนมผงสำหรับทารก วิธีการนี้มีลักษณะการเตรียมตัวอย่างที่ง่าย ความไวสูง และความเป็นเชิงเส้นที่ดี ให้ข้อมูลอ้างอิงที่เป็นประโยชน์สำหรับการตรวจวัด HMOs ในอาหาร.
คำสำคัญ: เครื่องโครมาโทกราฟไอออน; โอลิโกแซ็กคาไรด์ในนมแม่; ตัวตรวจวัดแบบแอมเพอโรเมตริก.
1. เครื่องมือ อุปกรณ์ และสารเคมี
1.1 สารเคมีและมาตรฐาน
ตารางที่ 1. รายการสารเคมีและมาตรฐาน
1.2 วัสดุในห้องปฏิบัติการและอุปกรณ์เสริม
- 1.2.1 เครื่องชั่งวิเคราะห์ (ความละเอียด 0.1 มก.);
- 1.2.2 อ่างน้ำควบคุมอุณหภูมิ;
- 1.2.3 เครื่องปั่นเหวี่ยง;
- 1.2.4 แผ่นกรองเมมเบรนโพลีอีเทอร์ซัลโฟน (PES) สำหรับน้ำ (0.45 ไมโครเมตร);
- 1.2.5 น้ำบริสุทธิ์;
- 1.2.6 อุปกรณ์กรองสุญญากาศ;
- 1.2.7 คาร์ทริดจ์เตรียมตัวอย่างแบบ RP solid-phase extraction (SPE);
- 1.2.8 กระบอกฉีดยาแบบใช้แล้วทิ้ง (20 มล., 5 มล.).
2. วิธีการทดลอง
2.1 การเตรียมสารละลาย
- 2.1.1 สารละลายโซเดียมไฮดรอกไซด์ 200 มิลลิโมลาร์: ปิเปต 10.5 มล. ของ NaOH 50% เจือจางด้วยน้ำจนครบ 1000 มล. และกรองด้วยสุญญากาศ.
- 2.1.2 สารละลายผสมของ NaOH 75 มิลลิโมลาร์ และโซเดียมอะซิเตต 250 มิลลิโมลาร์: ชั่งโซเดียมอะซิเตต 20.51 กรัม อย่างแม่นยำ ละลายในน้ำและถ่ายลงในขวดวัดปริมาตรขนาด 1000 มล. ปิเปต NaOH 50% 3.95 มล. อย่างแม่นยำ เจือจางด้วยน้ำบริสุทธิ์จนครบ 1000 มล. และกรองด้วยสุญญากาศ.
- 2.1.3 สารละลายกรดซัลโฟซาลิไซลิก 3%: ชั่งกรดซัลโฟซาลิไซลิก 3.0 กรัม ละลายในน้ำและเจือจางจนครบ 100 มล. (เตรียมสดใหม่).
- 2.1.4 สารละลายมาตรฐานผสมเข้มข้น: ชั่ง 2'-fucosyllactose, 3'-fucosyllactose, 3'-sialyllactose, 6'-sialyllactose, lacto-N-tetraose และ lacto-N-neotetraose อย่างละ 5 มก. (ถึงทศนิยมตำแหน่งที่ 1) อย่างแม่นยำ ใส่ในขวดวัดปริมาตรขนาด 10 มล. ละลายในน้ำและเจือจางจนถึงขีดเพื่อเตรียมสารละลายมาตรฐานผสมเข้มข้น 500 มก./ล. แยกชั่ง difucosyllactose 1 มก. (ถึงทศนิยมตำแหน่งที่ 1) อย่างแม่นยำ ใส่ในขวดวัดปริมาตรขนาด 10 มล. ละลายและเจือจางจนถึงขีดเพื่อเตรียมสารละลายมาตรฐานเข้มข้น 100 มก./ล.
- 2.1.5 สารละลายมาตรฐานผสมใช้งาน: ปิเปตสารละลายมาตรฐานผสมเข้มข้น (2.1.4) อย่างแม่นยำลงในขวดวัดปริมาตรและเจือจางด้วยน้ำเพื่อเตรียมสารละลายมาตรฐานผสมใช้งานของ 2'-FL, 3'-FL, 3'-SL, 6'-SL, LNT, LNnT และ DFL ที่ความเข้มข้น 0.5, 2, 4, 6, 8 และ 10 มก./ล. เตรียมสดใหม่ก่อนใช้งาน.
2.2 การเตรียมตัวอย่าง
ชั่งตัวอย่างประมาณ 2.0 กรัม ลงในบีกเกอร์ขนาดเล็ก ผสมให้เข้ากันกับน้ำอุ่น 50 มล. (ประมาณ 50 °C) เติมสารละลายกรดซัลโฟซาลิไซลิก 3% 40 มล. ถ่ายลงในขวดวัดปริมาตรและเจือจางจนครบ 100 มล. และบ่มด้วยอัลตราซาวด์เป็นเวลา 10 นาที กรองด้วยกระดาษกรองหรือปั่นเหวี่ยง (12,000 รอบ/นาที, 15 นาที) นำสารละลายตัวอย่างผ่านคาร์ทริดจ์ RP SPE แล้วผ่านแผ่นกรองเมมเบรนน้ำ 0.45 ไมโครเมตร ทิ้ง 3 มล. แรกและเก็บสารชะล้างเพื่อวิเคราะห์ ก่อนใช้งาน ให้เตรียมคาร์ทริดจ์ RP SPE ด้วยเมทานอล 20 มล. ตามด้วยน้ำ 15 มล. และปรับสมดุลเป็นเวลา 30 นาที.
2.3 สภาวะการทดลอง
2.3.1 สภาวะการโครมาโทกราฟีไอออน
3. ผลการทดลอง
3.1 ช่วงเชิงเส้น
วิเคราะห์สารละลายมาตรฐานผสมใช้งานที่เหมาะสม ช่วงเชิงเส้นคือ 0.5–10 มก./ล. ค่าเบี่ยงเบนระหว่างความเข้มข้นที่วัดได้กับความเข้มข้นที่ระบุอยู่ภายในค่าเบี่ยงเบนสูงสุดที่อนุญาต ค่า R² สูงกว่า 0.999 และส่วนประกอบทั้งหมดแสดงความเป็นเชิงเส้นที่ดี
ตารางที่ 2. ช่วงเชิงเส้นของสารประกอบ
รูปที่ 1. กราฟโครมาโทแกรมของมาตรฐาน HMO เจ็ดชนิดที่ซ้อนทับกัน
3.2 ผลการทดสอบตัวอย่าง
ตัวอย่างที่ 1 และ 2 ถูกทดสอบหลังจากการเจือจาง 10 เท่า คำนวณปริมาณ HMO แต่ละชนิดดังนี้: X คือปริมาณในตัวอย่าง (มก./100 กรัม); c คือความเข้มข้นในสารละลายตัวอย่างจากกราฟมาตรฐาน (มก./ล.); V คือปริมาตรคงที่ (มล.); m คือมวลตัวอย่าง (ก.); f คือปัจจัยการเจือจาง ปริมาณที่คำนวณได้ (มก./100 กรัม) มีดังนี้:
รูปที่ 2. กราฟโครมาโทแกรมของตัวอย่างที่ 1 เจือจาง 10 เท่า
รูปที่ 3. กราฟโครมาโทแกรมของตัวอย่างที่ 2 เจือจาง 10 เท่า
ตารางที่ 3. ผลการทดสอบตัวอย่าง
3.3 ความแม่นยำ
วิเคราะห์สารละลายใช้งานที่ระดับการสอบเทียบที่สี่ด้วยการฉีดต่อเนื่องหกครั้งภายใต้สภาวะใน 2.3.1 คำนวณค่า RSD ของปริมาณ HMO เจ็ดชนิดเพื่อประเมินความสามารถในการทำซ้ำ ผลลัพธ์ด้านล่างแสดงถึงความแม่นยำของวิธีที่ดี
3.3.1 ความแม่นยำในการทำซ้ำของมาตรฐาน
ผลการทดสอบ:
รูปที่ 4. กราฟโครมาโทแกรมที่ซ้อนทับกันของการฉีดมาตรฐานการสอบเทียบ S4 ซ้ำๆ กัน
ตารางที่ 4. ความแม่นยำในการทำซ้ำของมาตรฐาน
3.4 ขีดจำกัดการตรวจวัดและขีดจำกัดการหาปริมาณ
LOD: วิเคราะห์สารละลายมาตรฐานที่เจือจางเป็นสารละลายผสมที่มี 3'-FL 10 ไมโครกรัม/ลิตร, DFL 30 ไมโครกรัม/ลิตร, 2'-FL 30 ไมโครกรัม/ลิตร, LNnT 22 ไมโครกรัม/ลิตร, LNT 67 ไมโครกรัม/ลิตร, 6'-SL 67 ไมโครกรัม/ลิตร และ 3'-SL 160 ไมโครกรัม/ลิตร เตรียมและวิเคราะห์ตัวอย่างคู่ขนาน 20 ตัวอย่าง.
LOQ: วิเคราะห์สารละลายมาตรฐานที่เจือจางเป็นสารละลายผสมที่มี 3'-FL 30 ไมโครกรัม/ลิตร, DFL 80 ไมโครกรัม/ลิตร, 2'-FL 90 ไมโครกรัม/ลิตร, LNnT 65 ไมโครกรัม/ลิตร, LNT 200 ไมโครกรัม/ลิตร, 6'-SL 200 ไมโครกรัม/ลิตร และ 3'-SL 500 ไมโครกรัม/ลิตร เตรียมและวิเคราะห์ตัวอย่างคู่ขนานหกตัวอย่าง.
ผลการทดสอบมีดังนี้:
ตารางที่ 5. ผล S/N สำหรับ LOD และ LOQ ของ HMO เจ็ดชนิด
3.5 ความจำเพาะ
เติมสารละลายมาตรฐานกลูโคส ฟรุกโตส ซูโครส และมอลโตส อย่างละ 100 ไมโครลิตร ลงในขวดวัดปริมาตรขนาด 10 มล. และเจือจางจนถึงขีดด้วยสารละลายตัวอย่างที่ 2 เจือจาง 67 เท่า วิเคราะห์สารละลายเพื่อตรวจสอบว่าน้ำตาลเหล่านี้รบกวนพีคของ HMO เจ็ดชนิดหรือไม่ ดังที่แสดงด้านล่าง น้ำตาลทั้งสี่ชนิดไม่แสดงการรบกวนอย่างมีนัยสำคัญต่อการกำหนด HMO เจ็ดชนิดในนมผง
รูปที่ 5. กราฟโครมาโทแกรมที่ซ้อนทับกันของมาตรฐานการสอบเทียบ S6, ตัวอย่างที่ 2 และตัวอย่างที่ 2 ที่เติมสารละลายมาตรฐานน้ำตาลสี่ชนิด
4. สรุป
การตรวจสอบความถูกต้องนี้ใช้เครื่องโครมาโทกราฟไอออน WAYEAL เพื่อยืนยันวิธีการกำหนด HMOs ในอาหาร ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าพีคโครมาโทกราฟทั้งหมดมีรูปร่างดีโดยไม่มีการหางพีค 2'-FL, 3'-FL, DFL, LNnT, LNT, 6'-SL และ 3'-SL ทั้งหมดจะถูกชะล้างภายใน 60 นาที ความไวเป็นไปตามข้อกำหนดมาตรฐานของประเทศ และค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เชิงเส้นทั้งหมดสูงกว่า 0.999 ความสามารถในการทำซ้ำของทั้งมาตรฐานและตัวอย่างดี ยกเว้นไซลาลิลแลคโตสสองชนิด LOD และ LOQ อยู่ในระดับไมโครกรัม/ลิตร วิธีการนี้มีความจำเพาะที่ดี ไม่พบสิ่งเจือปนที่รบกวน และโดยรวมเป็นไปตามข้อกำหนดมาตรฐาน
