การหาปริมาณอะฟลาทอกซิน B₁ ซึ่งเป็นสารก่อมะเร็งกลุ่ม 1 ในพืชที่มีน้ำมันโดยระบบ Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS

อะฟลาทอกซิน บี₁เป็นสารทุติยภูมิที่มีพิษสูงซึ่งส่วนใหญ่ผลิตโดย แอสเปอร์จิลลัส ฟลาวัสและเชื้อราแอสเปอร์จิลลัส ในกลุ่มอะฟลาทอกซินมีความเป็นพิษรุนแรงที่สุดและมีการกระจายตัวกว้างที่สุด มันออกฤทธิ์เป็นพิษโดยการยับยั้งการสังเคราะห์ DNA และ RNA ในเซลล์ และรบกวนการเผาผลาญโปรตีน โดยมีผลเสียหายต่อตับอย่างตรงเป้าหมายเมื่อเปรียบเทียบกับสารพิษจากเชื้อราอื่นๆ เช่น ochratoxic และ patulin แล้ว อะฟลาทอกซินบี₁เป็นพิษอย่างยิ่งและมีสารก่อมะเร็งที่เป็นที่ยอมรับ มันถูกจัดประเภทเป็น สารก่อมะเร็งกลุ่มที่ 1โดยองค์การอนามัยโลก (WHO) มักตรวจพบในพืชที่มีน้ำมัน เช่น ถั่วลิสง ข้าวโพด ถั่วเปลือกแข็ง และน้ำมันพืช ทำให้สารปนเปื้อนมีความสำคัญต่อการควบคุมความปลอดภัยของอาหารทั่วโลก

การปนเปื้อนด้วยอะฟลาทอกซินบี₁มักเกิดขึ้นเมื่อพืชที่มีน้ำมันสัมผัสกับอุณหภูมิและความชื้นสูงระหว่างการปลูก การเก็บเกี่ยว หรือการเก็บรักษา ซึ่งส่งเสริมการเจริญเติบโตของเชื้อรา นอกจากนี้เนื่องจากคุณสมบัติทางเคมีที่เสถียรอะฟลาทอกซินบี₁ไม่สามารถถูกทำลายได้ด้วยอุณหภูมิในการปรุงอาหารแบบเดิมๆ ทำให้เกิดปัญหาสารตกค้างในผลิตภัณฑ์ทางการเกษตรและอาหารแปรรูปซ้ำๆ

การกลืนกินขนาดสูงในระยะสั้นอาจทำให้เกิดพิษเฉียบพลัน โดยแสดงอาการ เช่น ปวดท้องอย่างรุนแรง อาเจียน ดีซ่าน และตับวาย ซึ่งอาจถึงแก่ชีวิตได้ในกรณีที่รุนแรง การได้รับสารในปริมาณน้อยเป็นเวลานานทำให้เกิดการสะสมในตับ ทำให้เกิดการบาดเจ็บที่ตับเรื้อรัง เช่น พังผืดในตับและโรคตับแข็ง และอาจกระตุ้นให้เกิดมะเร็งตับระยะแรกด้วยซ้ำ ประชากรที่มีภูมิคุ้มกันต่ำ รวมถึงเด็ก ผู้สูงอายุ และบุคคลที่เป็นโรคตับอยู่แล้ว มีความเสี่ยงสูงต่ออะฟลาทอกซินบี₁พิษ

ในประเทศจีน มาตรฐานแห่งชาติ GB 2761-2017 (มาตรฐานความปลอดภัยด้านอาหารแห่งชาติ – ระดับสูงสุดของสารพิษจากเชื้อราในอาหาร) ระบุขีดจำกัดสารตกค้างสูงสุดสำหรับอะฟลาทอกซินบี₁ในอาหารประเภทต่างๆ นอกจากนี้ GB 5009.22-2016 (มาตรฐานความปลอดภัยด้านอาหารแห่งชาติ – การกำหนดอะฟลาทอกซิน B และ G ในอาหาร)จัดให้มีวิธีการวิเคราะห์อย่างเป็นทางการสำหรับการตรวจหาอะฟลาทอกซินบี₁.

เอกสารการใช้งานนี้อธิบายถึงการสร้างวิธีโครมาโตกราฟีของเหลวแบบเจือจางด้วยไอโซโทป-แมสสเปกโตรเมทรี (LC-MS/MS) สำหรับการเจือจางไอโซโทปสำหรับการตรวจวัดอะฟลาทอกซิน B₁ใช้ระบบ Wayeal LCMS-TQ9200 LC-MS/MS

คำสำคัญ:ทริปเปิลสี่เท่า; อะฟลาทอกซิน บี₁; โครมาโตกราฟีของเหลวเจือจางด้วยไอโซโทป-แมสสเปกโตรเมตรีแบบตีคู่

1. เครื่องมือและรีเอเจนต์

1.1 การกำหนดค่าเครื่องมือ

ตารางที่ 1 รายการการกำหนดค่าเครื่องมือ

1.2 รีเอเจนต์และมาตรฐาน

ตารางที่ 2 รีเอเจนต์และมาตรฐาน

1.3 วัสดุการทดลองและอุปกรณ์เสริม

เครื่องผสมน้ำวน

เครื่องหมุนเหวี่ยงความเร็วสูง

ความสมดุลเชิงวิเคราะห์

เครื่องหมุนเหวี่ยง

ท่อร่วมสกัดโซลิดเฟส (SPE) (พร้อมปั๊มสุญญากาศ)

เครื่องระเหยไนโตรเจน

เชคเกอร์

2. วิธีการทดลอง

2.1 การเตรียมสารละลาย

2.1.1 5 มิลลิโมล/ลิตร สารละลายแอมโมเนียมอะซิเตต:ชั่งน้ำหนักแอมโมเนียมอะซิเตต 0.39 กรัม ละลายในน้ำ และเจือจางให้เป็น 1,000 มล. ผสมให้เข้ากัน

2.1.1 สารละลายเมธานอล-อะซิโตไนไตรล์:เติมอะซีโตไนไตรล์ 100 มล. ลงในเมทานอล 100 มล. จากนั้นผสมให้เข้ากัน

2.2 การปรับสภาพตัวอย่าง

2.2.1 การสกัดตัวอย่าง

ส่งแป้งสาลีผ่านตะแกรงทดสอบขนาดรูรับแสง 2 มม. ชั่งน้ำหนักตัวอย่าง 5 กรัม (แม่นยำถึง 0.01 กรัม) ลงในหลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยงขนาด 50 มล. เพิ่ม 100มL ของสารละลายมาตรฐานภายในไอโซโทป (100 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) ผสมโดยการหมุนวน และปล่อยให้ยืนเป็นเวลา 30 นาที เติมสารละลายเมทานอล-น้ำ 20 มล. (70+30, ปริมาตร/ปริมาตร) กระแสน้ำวนเพื่อผสม และเขย่าขวดเชคเกอร์แบบวงโคจรเป็นเวลา 20 นาที ปั่นเหวี่ยงที่ 6000r/นาที เป็นเวลา 10 นาที รวบรวมส่วนเหนือตะกอนเพื่อใช้ในภายหลัง

2.2.2 การทำให้ตัวอย่างบริสุทธิ์

ถ่ายส่วนลอยเหนือตะกอน 4 มล. ลงในภาชนะอย่างถูกต้อง เติม Triton X-100 1% 23 มล. ใน PBS และผสมให้เข้ากัน

หลังจากที่ของเหลวเดิมในคอลัมน์อิมมูโนอัฟฟินิตี้ระบายจนหมด ให้ย้ายสารละลายตัวอย่างข้างต้นลงในกระบอกฉีดยาขนาด 50 มล. ปรับอัตราการไหลเพื่อให้สารละลายตัวอย่างไหลผ่านคอลัมน์อย่างต่อเนื่องที่อัตรา 1–3 มล./นาที หลังจากที่สารละลายตัวอย่างระบายออกหมดแล้ว ให้เติมน้ำ 2 × 10 มล. ลงในกระบอกฉีดยา และล้างคอลัมน์อิมมูโนอัฟฟินิตี้ด้วยอัตราการไหลคงที่ หลังจากที่น้ำระบายออกแล้ว ให้ทำให้คอลัมน์แห้งโดยใช้ปั๊มสุญญากาศ

ยกเลิกการเชื่อมต่อระบบสูญญากาศ วางหลอดทดลองขนาด 10 มล. ไว้ใต้คอลัมน์อิมมูโนอัฟฟินิตี้ ถอดกระบอกฉีดยาขนาด 50 มล. ออก และเติมเมทานอล 2 × 1 มล. เพื่อชะล้างคอลัมน์ที่อัตราการไหลแบบควบคุมที่ 1–3 มล./นาที จากนั้นทำให้คอลัมน์แห้งอีกครั้งโดยใช้ปั๊มสุญญากาศ รวบรวมสารชะทั้งหมดลงในหลอดทดลองค่อยๆ ระเหยสารชะออกจนเกือบแห้งภายใต้กระแสไนโตรเจนที่อุณหภูมิ 50 °C เติมเฟสเคลื่อนที่เริ่มต้น 1 มล. หมุนวนเป็นเวลา 30 วินาทีเพื่อละลายสารตกค้าง กรองผ่านตัวกรองเมมเบรน 0.22 μm และรวบรวมสิ่งที่กรองลงในขวดเก็บตัวอย่างอัตโนมัติสำหรับการฉีดครั้งต่อไป

2.3 เงื่อนไขการทดลอง

2.3.1 วิธีโครมาโตกราฟีของเหลว

คอลัมน์: C18, 1.7มม.2.1×50 มม

เฟสเคลื่อนที่ เฟส: A: สารละลายเมทานอล-อะซีโตไนไตรล์; เฟส B: สารละลายแอมโมเนียมอะซิเตต 5 มิลลิโมล/ลิตร

อัตราการไหล: 0.3 มล./นาที

อุณหภูมิคอลัมน์: 40°ค

ปริมาณการฉีด: 3µL

2.3.2 วิธีแมสสเปกโตรเมทรี

ตารางที่ 3 พารามิเตอร์มวลสารสเปกโตรมิเตอร์

หมายเหตุ: เครื่องหมายดอกจัน (*) หมายถึงไอออนเชิงปริมาณ

3. ผลการทดลอง

3.1 โครมาโตแกรมมาตรฐาน

การกำหนดปริมาณอะฟลาทอกซินบี₁และมาตรฐานภายในไอโซโทป 13C17-อะฟลาทอกซินบี₁เสร็จภายใน 5 นาที ดังที่แสดงในรูปที่ 1 สารวิเคราะห์ทั้งสองแสดงรูปร่างยอดที่ดีเยี่ยมและการตอบสนองที่น่าพอใจ ซึ่งเป็นไปตามข้อกำหนดสำหรับการวิเคราะห์เชิงทดลอง

รูปที่ 1 โครมาโตแกรมของอะฟลาทอกซินบี₁และมาตรฐานภายในไอโซโทป 13ค17​-อะฟลาทอกซิน บี₁

3.2 ช่วงเชิงเส้น

ปริมาตรที่เหมาะสมของสารละลายสต็อกมาตรฐานและสารละลายมาตรฐานภายในไอโซโทปแบบผสมได้รับการถ่ายโอนและเจือจางด้วยเฟสเคลื่อนที่เริ่มต้นอย่างแม่นยำ เพื่อเตรียมชุดโซลูชันการทำงานมาตรฐานที่มีอะฟลาทอกซิน B₁ความเข้มข้น 50, 20, 10, 5, 2, 1 และ 0.5ng/mL สารละลายแต่ละชนิดมีมาตรฐานภายในของไอโซโทปที่ความเข้มข้น 2 นาโนกรัม/มิลลิลิตร เส้นโค้งการสอบเทียบถูกสร้างขึ้นโดยใช้มาตรฐานเหล่านี้ เกินช่วงเชิงเส้น 0.5–50 นาโนกรัม/มิลลิลิตร และหลังการแก้ไขโดยใช้ 13C 17-อะฟลาทอกซิน B₁เป็นมาตรฐานภายใน ส่วนเบี่ยงเบนระหว่างอะฟลาทอกซินบีที่วัดได้กับระบุ₁ความเข้มข้นอยู่ภายในค่าเบี่ยงเบนสูงสุดที่อนุญาต ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ (R) มากกว่า 0.999 ซึ่งบ่งชี้ถึงความเป็นเชิงเส้นที่ดีเยี่ยม

รูปที่ 2 เส้นโค้งมาตรฐานของอะฟลาทอกซินบี₁

3.3 การทำซ้ำ

สารละลายมาตรฐานที่ความเข้มข้นสามระดับ (1, 10 และ 20 นาโนกรัม/มิลลิลิตร) ถูกฉีดหกครั้งติดต่อกัน ผลลัพธ์แสดงอยู่ในตารางด้านล่าง ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานสัมพัทธ์ (RSD) ของเวลากักเก็บและปริมาณตัวอย่างสำหรับอะฟลาทอกซินบี₁ที่ความเข้มข้นต่ำ ปานกลาง และสูงทั้งหมดอยู่ภายใน 5% ซึ่งเป็นไปตามข้อกำหนดของการทดลอง

ตารางที่ 4 การทดสอบความสามารถในการทำซ้ำของอะฟลาทอกซินบี₁ที่ความเข้มข้นต่ำ ปานกลาง และสูง

3.4 การกู้คืนสไปค์

อะฟลาทอกซิน บี₁สารละลายมาตรฐานถูกเติมเข้าไปในตัวอย่างเพื่อให้ได้ความเข้มข้นสุดท้ายที่ 5 นาโนกรัม/มิลลิลิตร จากนั้นตัวอย่างที่ถูกแทงถูกวิเคราะห์โดย LC-MS/MS ผลลัพธ์โดยเฉลี่ยจากการฉีดหกครั้งติดต่อกันคือ 5.147ng/mL โดยมี RSD อยู่ที่ 1.954% อัตราการฟื้นตัวที่คำนวณได้คือ 102.94% ซึ่งตรงตามข้อกำหนดของการทดสอบ

3.5 สารตกค้างเปล่า

หลังจากฉีดสารละลายมาตรฐาน 20 ng/mL อย่างต่อเนื่อง จากนั้นจึงฉีดตัวอย่างเปล่าเพื่อประเมินการเคลื่อนย้าย ดังแสดงในรูปที่ 3 ไม่พบการยกยอดในตัวอย่างเปล่า

รูปที่ 3 โครมาโตแกรมเปล่าของสารประกอบ

3.6 การทดสอบตัวอย่าง

อะฟลาทอกซิน บี₁ตรวจไม่พบในตัวอย่างนี้ (รูปที่ 4)

รูปที่ 4 โครมาโตแกรมของอะฟลาทอกซินบี₁ในตัวอย่าง A

4. บทสรุป

ในการศึกษานี้ วิธีโครมาโตกราฟีของเหลวแบบเจือจางด้วยไอโซโทป-แมสสเปกโตรเมทรี (LC-MS/MS) สำหรับการเจือจางอะฟลาทอกซิน B₁ก่อตั้งขึ้นโดยใช้ระบบ Wayeal LCMS-TQ9200 ลิควิดโครมาโทกราฟี-มวลสเปกโตรมิเตอร์แบบตีคู่ ข้อมูลที่ได้รับแสดงให้เห็นว่าพีคโครมาโตกราฟีทั้งหมดแสดงรูปร่างพีคที่ดีโดยไม่มีหาง ความไวตรงตามข้อกำหนดการทดลอง และค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ (R) มากกว่า 0.999 ซึ่งเป็นไปตามเกณฑ์ความเป็นเส้นตรง ความสามารถในการทำซ้ำที่ความเข้มข้นต่ำ ปานกลาง และสูงอยู่ภายใน 5% และจะไม่มีการตรวจพบการยกของระบบหลังจากการฉีดตัวอย่างที่มีความเข้มข้นสูง ผลลัพธ์เหล่านี้บ่งชี้ว่าวิธีการนี้ เมื่อติดตั้งระบบเวย์ลลิควิดโครมาโทกราฟี-แทนเดมแมสสเปกโตรเมทรี จะตอบสนองข้อกำหนดสำหรับการวิเคราะห์เชิงคุณภาพและเชิงปริมาณตามปกติของตัวอย่างเป้าหมาย