การกําหนดส่วนเหลือของยาปฏิชีวนะ Amphenicol ในเนื้อไก่ โดย Wayeal LCMS-TQ9200

คำสำคัญ: LCMS, แอมเฟนิคอล, ความปลอดภัยของอาหาร, สารตกค้างของยาปฏิชีวนะ

1. เครื่องมือและน้ำยา

1.1 รายการกำหนดค่าของ LCMS

ตารางที่ 1 รายการกำหนดค่าเครื่องมือ

1.3 วัสดุการทดลองและอุปกรณ์เสริม

เครื่องทำความสะอาดด้วยคลื่นเสียง

เครื่องผสมสารแบบ Vortex

เครื่องระเหยไนโตรเจนในอ่างน้ำ

เครื่องหมุนเหวี่ยงความเร็วสูง

2. วิธีการทดลอง

2.1 การเตรียมสารละลาย

2.1.1 สารละลายเอทิลอะซิเตทแอมโมเนีย 2%: นำน้ำแอมโมเนีย 4 มล. และเจือจางด้วยเอทิลอะซิเตทให้ได้ 200 มล.

2.1.2 สารละลายโซเดียมคลอไรด์ 4%: นำโซเดียมคลอไรด์ 4 กรัม ละลายในน้ำ และเจือจางให้ได้ 100 มล.

2.1.3 สารละลาย n-เฮกเซนอิ่มตัวด้วยโซเดียมคลอไรด์ 4%: นำสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 4% ในปริมาณที่เหมาะสม เติม n-เฮกเซนส่วนเกิน ผสม ตั้งทิ้งไว้ให้เกิดการแยกชั้น และนำชั้น n-เฮกเซนด้านบน

2.1.4 สารละลายทำงานของสารมาตรฐานภายในแบบผสม: นำสารละลายสต็อกของสารมาตรฐานภายในแบบผสมในปริมาณที่เหมาะสม เจือจางด้วยเมทานอล 20% เพื่อให้ได้คลอแรมเฟนิคอล-D5 ที่ 10ng/mL และสารมาตรฐานภายในอื่นๆ (ฟลอร์เฟนิคอล-D3, ไทแอมเฟนิคอล-D3 และฟลอร์เฟนิคอลเอมีน-D3) ที่ 50ng/mL

2.2 การเตรียมตัวอย่าง

2.2.1 การสกัดตัวอย่าง: ชั่งตัวอย่าง 2 กรัม (แม่นยำถึง ±0.01 กรัม) เติมสารละลายทำงานของสารมาตรฐานภายในแบบผสม 100µL ผสมด้วย Vortex เป็นเวลา 1 นาที เติมสารละลายเอทิลอะซิเตทแอมโมเนีย 2% 10 มล. ผสมด้วย Vortex เป็นเวลา 10 นาที หมุนเหวี่ยงที่ 8000rpm เป็นเวลา 5 นาที และเก็บส่วนใส เติมสารละลายเอทิลอะซิเตทแอมโมเนีย 2% อีก 10 มล. ลงในสารตกค้าง และทำซ้ำขั้นตอนการสกัด รวมส่วนใสทั้งสอง ระเหยให้แห้งภายใต้กระแสไนโตรเจนที่ 50°C และเก็บไว้ใช้

2.2.2 การทำให้บริสุทธิ์ของตัวอย่าง: เติมสารละลายโซเดียมคลอไรด์ 4% 3 มล. ลงในสารตกค้างจากการทำให้บริสุทธิ์ ผสมด้วย Vortex เพื่อละลาย จากนั้นเติมสารละลาย n-เฮกเซนอิ่มตัวด้วยโซเดียมคลอไรด์ 4% 5 มล. ผสมด้วย Vortex เป็นเวลา 30 วินาที หมุนเหวี่ยงที่ 8000 rpm เป็นเวลา 5 นาที และทิ้งชั้น n-เฮกเซนด้านบน ทำซ้ำขั้นตอนการกำจัดไขมันหนึ่งครั้ง เติมสารละลายเอทิลอะซิเตทแอมโมเนีย 2% 5 มล. ผสมด้วย Vortex เป็นเวลา 10 นาที หมุนเหวี่ยงที่ 8000 rpm เป็นเวลา 5 นาที และเก็บส่วนใส เติมสารละลายเอทิลอะซิเตทแอมโมเนีย 2% อีก 5 มล. ลงในสารตกค้าง และทำซ้ำขั้นตอนการสกัด รวมส่วนใส ระเหยให้แห้งภายใต้กระแสไนโตรเจนที่ 50°C เติมสารละลายเมทานอล 20% 1 มล. ผสมด้วย Vortex เป็นเวลา 30 วินาที กรองผ่านเมมเบรน และรอการวิเคราะห์ด้วยเครื่องมือ

2.3 เงื่อนไขการทดลอง

2.3.1 เงื่อนไขโครมาโทกราฟีของเหลว

คอลัมน์โครมาโทกราฟี: C18 1.7μm 2.1x50mm

เฟสเคลื่อนที่: A: อะซิโตไนไทรล์; B: 2 mM แอมโมเนียมฟอร์เมตในน้ำ

อัตราการไหล: 0.3mL/min

อุณหภูมิคอลัมน์: 40 ℃

ปริมาณการฉีด: 5µL

2.3.2 เงื่อนไขสเปกโตรเมตรีมวล

ตารางที่ 3 พารามิเตอร์แหล่งไอออน

3. ผลการทดลอง

3.1 โครมาโทแกรมมาตรฐาน

การหาปริมาณยาปฏิชีวนะเอไมด์สี่ชนิดและสารมาตรฐานภายในเสร็จสิ้นภายใน 6 นาที ยอดทั้งหมดแสดงรูปร่างยอดที่ดีโดยไม่มีการเกิดหาง และแต่ละสารประกอบแสดงการตอบสนองที่น่าพอใจ ตรงตามข้อกำหนดในการทดลอง

รูปที่ 1 โครมาโทแกรมของยาปฏิชีวนะแอมเฟนิคอล 4 ชนิดและสารมาตรฐานภายใน (คลอแรมเฟนิคอล 0.2ng/mL, ยาปฏิชีวนะอื่นๆ 1ng/mL)

3.2 ช่วงเชิงเส้น

นำสารละลายมาตรฐานผสมแอลกอฮอล์เอไมด์ในปริมาณที่เหมาะสม และเจือจางเป็นขั้นตอนให้ได้ความเข้มข้นหลายชุดเพื่อเตรียมเส้นโค้งมาตรฐาน ใช้วิธีสารมาตรฐานภายในไอโซโทปสำหรับการวิเคราะห์เชิงปริมาณ ช่วงเชิงเส้นคือ 0.2-10 ng/mL สำหรับคลอแรมเฟนิคอล และ 1-50 ng/mL สำหรับฟลอร์เฟนิคอลเอมีน ไทแอมเฟนิคอล และฟลอร์เฟนิคอล ความเบี่ยงเบนระหว่างผลการตรวจจับเชิงเส้นและความเข้มข้นที่ทราบมีค่าน้อยกว่าค่าเบี่ยงเบนสูงสุดที่อนุญาต โดยมีค่า R² ตั้งแต่ 0.9958 ถึง 0.9998 ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความเป็นเส้นตรงที่ดีเยี่ยมสำหรับส่วนประกอบทั้งหมด

ตารางที่ 4 ช่วงเชิงเส้นของสารประกอบ

รูปที่ 2 ข้อมูลเส้นโค้งสอบเทียบของสารประกอบทั้งสี่ชนิด

3.3 LOD และ LOQ

มาตรฐานความปลอดภัยด้านอาหารแห่งชาติของจีน GB 31658.20-2022 ระบุว่าสำหรับวิธีนี้ ขีดจำกัดการตรวจจับ (LOD) สำหรับคลอแรมเฟนิคอลคือ 0.1µg/kg และขีดจำกัดการหาปริมาณ (LOQ) คือ 0.2µg/kg ในขณะที่สำหรับไทแอมเฟนิคอล ฟลอร์เฟนิคอล และฟลอร์เฟนิคอลเอมีน LOD คือ 0.5µg/kg และ LOQ คือ 1 µg/kg อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนสำหรับสารประกอบเป้าหมายทั้งหมดที่ความเข้มข้นที่ระบุของขีดจำกัดการตรวจจับ (LOD) และขีดจำกัดการหาปริมาณ (LOQ) มีค่ามากกว่า 3 และ 10 อย่างมีนัยสำคัญ ซึ่งสอดคล้องกับข้อกำหนดด้านความไวที่ระบุไว้ในมาตรฐานแห่งชาติ

ตารางที่ 5 ขีดจำกัดการตรวจจับและการหาปริมาณสำหรับแต่ละสารประกอบ

รูปที่ 3 โครมาโทแกรมของขีดจำกัดการตรวจจับและขีดจำกัดการหาปริมาณสำหรับสารประกอบทั้งสี่ชนิด

3.4 การทดสอบความแม่นยำ

นำสารละลายผสมมาตรฐานแอมเฟนิคอลที่มีความเข้มข้นต่ำ ปานกลาง และสูง และทำการฉีดติดต่อกันหกครั้งเพื่อเปรียบเทียบความเบี่ยงเบนในเวลาการคงอยู่และพื้นที่ยอด ผลลัพธ์แสดงอยู่ในตารางด้านล่าง ความเบี่ยงเบนของเวลาการคงอยู่ของสารประกอบแอมเฟนิคอลทั้งหมดน้อยกว่า 1% และความเบี่ยงเบนของพื้นที่ยอดน้อยกว่า 5% ซึ่งตรงตามข้อกำหนดด้านความแม่นยำของ RSD ≤ 15% ที่ระบุไว้ในมาตรฐานแห่งชาติ

ตารางที่ 6 การทดสอบความแม่นยำสำหรับแต่ละสารประกอบ

รูปที่ 4 โครมาโทแกรมความแม่นยำของสารประกอบแอลกอฮอล์เอไมด์สี่ชนิด

3.5 การทดสอบการกู้คืนการเติมเมทริกซ์

ความถูกต้องของวิธีการตรวจจับนี้ได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบการกู้คืนการเติม เพิ่มความเข้มข้นที่ทราบของตัวอย่างมาตรฐานลงในตัวอย่างเมทริกซ์เปล่าในอัตราส่วนต่างๆ สำหรับการเตรียมตัวอย่างก่อนการรักษา เตรียมตัวอย่างที่เติมเมทริกซ์ที่ความเข้มข้นสูง ปานกลาง และต่ำ ตัวอย่างที่เติมในแต่ละระดับความเข้มข้นได้รับการวิเคราะห์อย่างอิสระหกครั้ง คำนวณอัตราการกู้คืนโดยการเปรียบเทียบความเข้มข้นที่ตรวจพบในเมทริกซ์ก่อนและหลังการเติม จึงประเมินความถูกต้องของวิธี ผลลัพธ์แสดงดังนี้: ในเมทริกซ์ไก่ อัตราการกู้คืนการเติมของสารประกอบทั้งหมดมีตั้งแต่ 94.5% ถึง 107.2% โดยมี CV ภายใน 5% ซึ่งบ่งชี้ว่าความถูกต้องตรงตามข้อกำหนดของวิธี

ตารางที่ 6 อัตราการกู้คืนของสารประกอบในเมทริกซ์ไก่ที่เติม

3.6 การทดสอบตัวอย่าง

ตัวอย่างเนื้ออกไก่ที่ซื้อแบบสุ่มจากซูเปอร์มาร์เก็ตถูกสกัดและทำให้บริสุทธิ์โดยใช้วิธีการเตรียมตัวอย่างก่อนการรักษาที่กล่าวมาข้างต้น หลังจากทดสอบตัวอย่างบนเครื่องมือ ไม่พบยาปฏิชีวนะเอไมด์ทั้งสี่ชนิด

รูปที่ 5 โครมาโทแกรมของสารประกอบแอลกอฮอล์เอไมด์สี่ชนิดในตัวอย่างเนื้ออกไก่จากซูเปอร์มาร์เก็ต

4. บทสรุป

วิธีนี้ใช้อุปกรณ์โครมาโทกราฟีของเหลวสเปกโตรเมตรีมวล Wayeal LCMS-TQ9200 สำหรับการหาปริมาณยาปฏิชีวนะแอมเฟนิคอลในอาหารที่มาจากสัตว์ ทำให้สามารถรับสารประกอบได้พร้อมกันทั้งในโหมดไอออนบวกและลบ ข้อมูลระบุว่าวิธีนี้ให้ยอดโครมาโทกราฟีที่มีรูปร่างดีโดยไม่มีการเกิดหาง และความไวของมันตรงตามข้อกำหนดของมาตรฐานแห