การหาปริมาณสารตกค้างของ Erythromycin ในกากหมักยาปฏิชีวนะโดยใช้ระบบ Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Wayeal LCMS-TQ9200

Erythromycin เป็นยาปฏิชีวนะในกลุ่ม macrolide ที่ผลิตโดยการหมักของ Streptomyces erythreus ออกฤทธิ์ต้านแบคทีเรียโดยหลักการยับยั้งการสังเคราะห์โปรตีนของแบคทีเรีย การผลิต Erythromycin ส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับเทคโนโลยีชีวภาพการหมัก ซึ่งเกี่ยวข้องกับขั้นตอนต่างๆ เช่น การคัดเลือกสายพันธุ์ การเพาะเลี้ยงเมล็ดพันธุ์ การหมักในถังขนาดใหญ่ การสกัด และการทำให้บริสุทธิ์ หลังจากทำการหมักแล้ว จะทำการสกัด erythromycin ด้วยตัวทำละลายอินทรีย์ (เช่น บิวทิลอะซิเตท) ตามด้วยการทำให้บริสุทธิ์ผ่านการตกผลึกหรือการแยกเรซินแลกเปลี่ยนไอออน ซึ่งจะให้เกลือเกรดคลินิก (เช่น erythromycin ethylsuccinate) อย่างไรก็ตาม กระบวนการผลิต erythromycin จะสร้างกากใย (กากหมัก) จำนวนมาก ซึ่งอาจมีสารปฏิชีวนะตกค้าง โปรตีนจากจุลินทรีย์ และผลพลอยได้จากการเผาผลาญ หากไม่ได้รับการจัดการอย่างเหมาะสม กากเหล่านี้อาจเข้าสู่ห่วงโซ่ระบบนิเวศผ่านการปล่อยสู่สิ่งแวดล้อมหรือใช้เป็นสารเติมแต่งอาหารสัตว์ ซึ่งนำไปสู่ภัยอันตรายหลายประการ: Erythromycin ที่ตกค้างสามารถส่งเสริมการแพร่กระจายของยีนต้านทานยาปฏิชีวนะในดินและแหล่งน้ำ ทำให้สมดุลของชุมชนจุลินทรีย์เสียไป ขยายผ่านห่วงโซ่อาหาร อาจทำให้เกิดสายพันธุ์แบคทีเรียที่ดื้อยาในสัตว์หรือมนุษย์ ซึ่งบ่อนทำลายประสิทธิภาพของยาปฏิชีวนะ นอกจากนี้ สสารอินทรีย์ที่ไม่ได้ใช้ประโยชน์ภายในกากยังสามารถก่อให้เกิดมลพิษต่อสิ่งแวดล้อมได้ ดังนั้น การควบคุมกากใยอย่างเข้มงวดจึงเป็นมาตรการที่สำคัญในการควบคุมมลพิษจากการผลิต erythromycin

การทดลองนี้ดำเนินการโดยอ้างอิงตามมาตรฐาน "T/PIAC 00003—2021 Group Standard of China Pharmaceutical Industry Association - วิธีการหาปริมาณ erythromycin ในสารตกค้างของยาปฏิชีวนะ วัสดุฐานปุ๋ยอินทรีย์ พืชผล และสื่อสิ่งแวดล้อม" โดยใช้ระบบสเปกโตรมิเตอร์มวลโครมาโทกราฟีของเหลว Wayeal LCMS-TQ9200 เพื่อหาปริมาณ erythromycin ในกากใย ผลการทดลองระบุว่าการทดสอบความเหมาะสมของระบบแสดงให้เห็นรูปร่างยอดที่ดีและเส้นตรงที่ดี ซึ่งเป็นไปตามข้อกำหนดในการทดลอง

1. เครื่องมือและน้ำยา

1.1 รายการกำหนดค่า LCMS

ตารางที่ 1 รายการกำหนดค่าเครื่องมือ

1.2 น้ำยาและสารมาตรฐาน

ตารางที่ 2 รายการน้ำยาและสารมาตรฐาน

1.3 วัสดุการทดลองและอุปกรณ์เสริม

เครื่องทำความสะอาดด้วยคลื่นเสียง

เครื่องผสมแบบวน

เครื่องหมุนเหวี่ยงความเร็วสูง

2. วิธีการทดลอง

2.1 การเตรียมตัวอย่าง

ชั่งน้ำหนักตัวอย่าง 0.5 กรัม (แม่นยำถึง 0.001 กรัม) ลงในหลอดทดลองที่มีจุกแก้ว เติมอะซิโตไนไทรล์ 50 มล. วนเป็นเวลา 1 นาทีเพื่อทำให้ส่วนผสมเป็นเนื้อเดียวกัน และทำการสกัดด้วยคลื่นเสียงเป็นเวลา 20 นาที จากนั้นถ่ายโอนส่วนผสมไปยังหลอดหมุนเหวี่ยงขนาด 50 มล. และหมุนเหวี่ยงที่ 4000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที รวบรวมสารละลายส่วนบนในปริมาณที่เหมาะสมและผ่านเมมเบรนกรองขนาด 0.22μm ทิ้งสารละลายเริ่มต้นอย่างน้อย 1 มล. จากนั้นถ่ายโอนสารละลายที่เหลือลงในขวด LC สีเหลืองอำพันเพื่อทำการวิเคราะห์

2.2 เงื่อนไขการทดลอง

2.2.1 เงื่อนไขวิธีการโครมาโทกราฟีของเหลว

คอลัมน์โครมาโทกราฟี: C18 1.7μm 2.1x50mm

เฟสเคลื่อนที่: A: อะซิโตไนไทรล์, B: กรดฟอร์มิก 0.1% ในน้ำ

อัตราการไหล: 0.3mL/min

อุณหภูมิคอลัมน์: 30℃

ปริมาณการฉีด: 2μL

2.2.2 เงื่อนไขวิธีการสเปกโตรมิเตอร์มวล

ตารางที่ 3 พารามิเตอร์แหล่งไอออนสเปกโตรเมตรีมวล

3. ผลการทดลอง

3.1 การทดสอบความเหมาะสมของระบบ

ผลการทดสอบความเหมาะสมของระบบแสดงให้เห็นยอดเป้าหมายที่กำหนดไว้อย่างดีโดยไม่มีการรบกวนจากยอดภายนอก ซึ่งเป็นไปตามข้อกำหนดในการทดลองทั้งหมด

รูปที่ 1 โครมาโทแกรมของสารละลายมาตรฐาน Erythromycin A (0.5ng/mL)

3.2 ช่วงเชิงเส้น

เตรียมเส้นโค้งสอบเทียบสำหรับ erythromycin A โดยการเจือจางสารละลายมาตรฐานเป็นชุดโดยใช้สารละลายทำงานที่มีความเข้มข้นปานกลาง เส้นโค้งแสดงให้เห็นความเป็นเส้นตรงที่ดีเยี่ยมในช่วง 0.5-500ng/mL โดยมีค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ (R²) มากกว่า 0.99

ตารางที่ 4 ช่วงเชิงเส้นของ Erythromycin A

รูปที่ 2 เส้นโค้งสอบเทียบสำหรับ Erythromycin A

3.3 ขีดจำกัดการตรวจวัด (LOD) และขีดจำกัดการหาปริมาณ (LOQ)

ในวิธีนี้ ขีดจำกัดการตรวจวัด (LOD) และขีดจำกัดการหาปริมาณ (LOQ) สำหรับสารละลายมาตรฐาน erythromycin A ถูกกำหนดให้เป็น 0.2ng/mL และ 0.5ng/mL ตามลำดับ อัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวน (S/N) ที่สอดคล้องกันคือ 110.02 และ 292.20 ซึ่งเกินกว่าข้อกำหนดขั้นต่ำ 3 และ 10 อย่างมาก จึงเป็นไปตามเกณฑ์ความไวในการทดลอง

รูปที่ 3 โครมาโทแกรมไอออนที่สกัดสำหรับ LOD และ LOQ ของ Erythromycin A

3.4 การทดสอบความแม่นยำ

ฉีดสารละลาย erythromycin A ติดต่อกันเจ็ดครั้ง โดยแสดงผลลัพธ์ในรูปด้านล่าง ค่าเบี่ยงเบนเวลาในการเก็บรักษาสำหรับ erythromycin A คือ 0.19% และค่าเบี่ยงเบนพื้นที่ยอดคือ 0.96% ซึ่งทั้งสองอย่างต่ำกว่า 5% ซึ่งเป็นไปตามข้อกำหนดในการทดลอง

รูปที่ 4 โครมาโทแกรมความแม่นยำของตัวอย่าง Erythromycin A (7 การฉีด)

3.5 การทดสอบตัวอย่าง

ตามวิธีการเตรียมตัวอย่างข้างต้น พื้นที่ยอดเป้าหมายในตัวอย่างของแข็งคือ 7.4E6 คำนวณโดยใช้วิธีมาตรฐานภายนอก ปริมาณ erythromycin A ในสารละลายตัวอย่างถูกกำหนดให้เป็น 400 ng/mL

รูปที่ 5 โครมาโทแกรมของการทดสอบตัวอย่าง Erythromycin A

4. บทสรุป

วิธีนี้ใช้ระบบสเปกโตรมิเตอร์มวลโครมาโทกราฟีของเหลว Wayeal LCMS-TQ9200 เพื่อหาปริมาณ erythromycin A ในสารตกค้างจากการหมักยาปฏิชีวนะ ข้อมูลระบุว่าวิธีนี้แสดงให้เห็นประสิทธิภาพที่ดีเยี่ยม: ยอดโครมาโทกราฟีทั้งหมดแสดงรูปร่างที่ดีที่สุดโดยไม่มีการเกิดหาง และความไวเป็นไปตามข้อกำหนดในการทดลอง ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์เชิงเส้น (R²) เกิน 0.99 ค่าเบี่ยงเบนเวลาในการเก็บรักษาและพื้นที่ยอดสำหรับสารประกอบทั้งหมดในการฉีดติดต่อกันเจ็ดครั้งอยู่ภายใน 1% ซึ่งบ่งชี้ถึงความแม่นยำสูง โครมาโทแกรมตัวอย่างไม่แสดงการรบกวนจากยอดภายนอก และปริมาณตัวอย่างที่วัดได้คือ 400ng/mL วิธีนี้ติดตั้งระบบ Wayeal LC-MS/MS ซึ่งเป็นไปตามข้อกำหนดสำหรับการวิเคราะห์เชิงคุณภาพและเชิงปริมาณตามปกติของตัวอย่างทดสอบ